Właśnie konsultant krajowy odwołał profilaktykę konfliktu serologicznego w ciąży z powodu drastycznego braku szczepionki.

Genetyczne badania prenatalne nie zawsze muszą być inwazyjne. Te polegające na analizie DNA płodu zawartego we krwi matki mogą w wielu przypadkach je zastąpić. Oczekując przyjścia na świat dziecka, każda mama chciałaby przede wszystkim, aby było zdrowie. W diagnostyce płodu przydają się badania prenatalne, pozwalające sprawdzić czy dziecko nie cierpi na rozmaitego rodzaju schorzenia czy też wady rozwojowe. Czasami są takie nieprawidłowości są niewielkie, dotyczą na przykład braku zawiązków niektórych zębów stałych, ale są i takie, które mogą zagrażać życiu lub wiążą się z przygotowaniem na całkowite przemodelowanie życia. Standardem badań prenatalnych są obecnie badania ultrasonograficzne płodu, które w połączeniu z badaniami biochemicznymi (poziomem hormonu beta HCG i białka PAPP-a w krwi matki), pozwalają określić prawdopodobieństwo np. zespołu Downa. Te badania zaliczają się do całkowicie bezpiecznych, zarówno dla matki, jak i rozwijającego się płodu. Wyniki tych badań często dają jednak tylko poszlaki, a nie twarde dowody, a nadto notuje się jednak około 20-30 procent błędnych rozpoznań. Między innymi dlatego, że analizowane parametry nie są ściśle związane z jakimś konkretnym zespołem genetycznym. Na przykład: poziom hormonu beta HCG może być wyższy czy niższy w zależności od tego, czy pacjentka pali lub nie papierosów. Większą pewność można zyskać za pomocą badań materiału DNA dziecka zawartego we krwi matki. Jak ten materiał genetyczny tam się dostaje? Złuszczone komórki płodu, które pływają w płynie owodniowym, w pewnym momencie się rozpadają. To DNA pozakomórkowe jest transportowane przez łożysko do krwi matki. Testy DNA materiału genetycznego dziecka z krwi matki mają dużą precyzję sięgającą ponad 99 procent. Pozwalają one wykryć nie tylko wady genetyczne, które wiążą się z występowaniem dodatkowego chromosomu w DNA, albo jego brakiem, na przykład zespół Downa czy zespół Turnera, ale też i te, które powstają wskutek ubytku fragmentu chromosomu. Te zespoły genetyczne również są problemem genetyki, a jeszcze do niedawna nie można ich było wykrywać. Wciąż jednak, mimo tego, że te badania mają znacznie większą czułość niż stosowane wcześniej metody analiz, ich wynik (pozytywny, czyli wskazujący na wadę) należy potwierdzić za pomocą amniopunkcji, gdzie sprawdza się DNA z całych komórek płodu. Jednak jeśli wynik takiego badania jest negatywny (czyli pozytywny dla matki: nie ma uszkodzeń), można raczej zacząć spać spokojnie. Dzięki możliwości zbadania pozakomórkowego DNA we krwi matki, liczba niepotrzebnie wykonywanych badań inwazyjnych może być ograniczona. Bo w tym przypadku bardzo rzadko dostajemy badanie fałszywie dodatnie. Istotne jest jednak, żeby kobieta w trakcie takich badań objęta była właściwą opieką lekarską - w tym, by mogła uzyskać konsultację lekarza genetyka. Wiele chorób wykrytych za pomocą testów DNA, zwłaszcza tych związanych z ubytkiem kawałka chromosomu czy jednego czy kilka genów, można zacząć leczyć niemal zaraz po urodzeniu. Wcześniej nie było to możliwe, bo w przypadku wielu zespołów, np. Georga czy Williamsa, na początku nie ma żadnych objawów albo są to objawy nieswoiste...

Poważne komplikacje związane z różnicą między grupami krwi rodziców dziecka są obecnie bardzo rzadkie. Dzięki osiągnięciom współczesnego położnictwa konflikt serologiczny nie stanowi już zagrożenia dla ciąży. Każdy z nas rodzi się z określoną grupą krwi. Grupę krwi danego człowieka określa mnóstwo antygenów. Najważniejsze to A, B i AB. Jeśli nie występuje żaden z nich, mówimy o grupie 0. Oprócz tego większość ludzi (w Polsce ok. 20%) ma we krwi dodatkowy czynnik Rh. Taką krew oznacza się jako Rh dodatnią (Rh+), w przeciwieństwie do pozbawionej go, czyli Rh ujemnej (Rh-). Konflikt serologiczny może wystąpić tylko wtedy, gdy matka jest Rh-, ojciec Rh +, a dziecko odziedziczy po nim czynnik Rh. Jeśli Rh dziecka w łonie matki jest dodatnie, może się ona na ten obcy czynnik uczulić. Pod warunkiem, że niewielka ilość czerwonych krwinek płodu przedostanie się do jej krwi i zostanie przez układ odpornościowy uznana za element wrogi, przeciw któremu zacznie on wytwarzać przeciwciała. Kiedy te z kolei przedostaną się do krwiobiegu dziecka, spowodują u niego rozpad czerwonych krwinek, anemię, obrzęki i inne poważne komplikacje. Zagrożenie nie dotyczy zwykle pierwszej ciąży. W kolejnej jednak, jeśli dziecko jest znowu Rh+, wytworzone wcześniej przeciwciała matki mogą przedostać się do jego krwi. Sytuacja, gdy oboje rodzice są Rh-, nie grozi konfliktem, ponieważ dziecko również musi być Rh ujemne. Dziś rzadko już dochodzi do poważnych powikłań z powodu konfliktu serologicznego. A to dzięki temu, że kobietom Rh ujemnym podaje się specjalną immunoglobulinę anty-D. Neutralizuje ona komórki płodowe w krwi matki, zanim jej organizm zdąży rozpoznać je jako wrogie i wytworzyć przeciwko nim przeciwciała. Immunoglobulinę anty-D podaje się w ciągu 72 godzin po porodzie wszystkim matkom Rh ujemnym, które urodziły dziecko Rh dodatnie, ponieważ w czasie porodu komórki płodu często przedostają się do krwiobiegu matki. Może się to również zdarzyć przy poronieniu, a także wtedy gdy kobieta doznała w ciąży urazu brzucha bądź miała zabieg amniopunkcji (pobranie płynu owodniowego). We wszystkich tych sytuacjach również podaje się immunoglobulinę. Stanowi to zabezpieczenie dla następnej ciąży. W krajach zachodnich immunoglobulinę anty-D dostają zapobiegawczo wszystkie Rh ujemne kobiety w 28. tygodniu ciąży. W Polsce nie robi się tego ze względów ekonomicznych. Podstawą wykrywania konfliktu serologicznego jest badanie obecności przeciwciał odpornościowych w surowicy krwi przyszłej mamy z Rh ujemną grupą krwi. Badanie to trzeba wykonać na początku ciąży i powtarzać co 2 miesiące. W razie stwierdzenia konfliktu serologicznego przyszła mama musi być pod bardzo szczegółową kontrolą lekarską. Zajmują się tym ośrodki wyspecjalizowane w prowadzeniu ciąż z konfliktem serologicznym. Konieczne jest regularne wykonywanie specjalistycznych USG, które pozwalają na pomiar przepływu krwi w tętnicy mózgu dziecka. Bardzo szybki przepływ wskazuje na anemię. W razie podejrzenia anemii u dziecka dokonuje się kordocentezy, czyli nakłucia pępowiny i bezpośredniej oceny morfologii jego krwi. Wynikłe z konfliktu serologicznego powikłania u dziecka można leczyć zarówno przed narodzinami jak i po nich. Leczenie w czasie ciąży polega na przetaczaniu dziecku odpowiednio dobranej krwi pod kontrolą USG bezpośrednio do pępowiny. Takie transfuzje można w razie konieczności powtarzać. Po porodzie oprócz niedokrwistości dziecko ma również wynikłą z rozpadu krwinek żółtaczkę. Leczenie polega na intensywnej fototerapii, czyli naświetlaniu specjalnymi lampami. Czasem konieczna jest również transfuzja wymienna krwi u dziecka.

Wczesna ocena czynników ryzyka oraz wykonanie badań profilaktycznych – oznaczenie grup krwi rodziców, badanie w kierunku obecności przeciwciał przeciwkrwinkowych u matki powtarzane odpowiednio często w trakcie ciąży. Działania te pozwalają na wczesne wykrycie konfliktu serologicznego, a także rozszerzenie diagnostyki i ewentualne włączenie leczenia w odpowiednim momencie, jeśli zajdzie taka potrzeba. Przy odpowiednim monitorowaniu oraz leczeniu ciąża jak najbardziej może zakończyć się pomyślnie. Aby dowiedzieć się, czy między Tobą a partnerem istnieje takie zestawienie, wystarczy wykonać badanie krwi. Można je wykonać przed zajściem w ciążę lub w każdym momencie jej trwania (zaleca się wykonanie tego badania już na początku ciąży). Podczas badania zostanie oznaczona grupa krwi, co pozwoli ocenić ryzyko wystąpienia konfliktu serologicznego. Takiemu badaniu powinna być poddana zarówno przyszła mama, jak i przyszły tata. Należy pamiętać, że nawet jeśli przyszli rodzice mają różne grupy krwi, potencjalnie dające ryzyko konfliktu serologicznego, nie musi on wystąpić, a szczególnie w pierwszej ciąży jest on bardzo mało prawdopodobny. Kolejnym czynnikiem decydującym o wystąpieniu konfliktu serologicznego jest grupa krwi płodu – jeśli jest odmienna od matczynej, konflikt może wystąpić, natomiast jeśli oboje, mama i płód, mają grupę krwi Rh(-), konflikt w zakresie tego antygenu nie wystąpi. Oprócz badania grupy krwi u każdej ciężarnej wykonuje się badanie w kierunku obecności przeciwciał przeciwkrwinkowych. Test nazywany odczynem Coombsa wykonywany jest w pierwszym trymestrze ciąży, razem z badaniem grupy krwi, a następnie powtarzany w każdym trymestrze ciąży. W pierwszej ciąży, a także jeśli w przypadku czynników ryzyka wdrożono odpowiednią profilaktykę (podanie immunoglobuliny anty-D), wytworzenie przeciwciał przez matkę jest mało prawdopodobne. Wystąpienie konfliktu serologicznego jest także zależne od grupy krwi dziecka. To oznacza, że samo zestawienie konfliktowe nie jest równoznaczne z tym, że wystąpi konflikt serologiczny. Jeśli przeciwciała są obecne we krwi matki, a krwinki dziecka zawierają antygen, przeciwko któremu przeciwciała są skierowane, to dopiero wówczas prawdopodobnie jest wystąpienie konfliktu serologicznego, zwanego również konfliktem matczyno-płodowym. W przypadku stwierdzenia przeciwciał konieczna jest stała kontrola ich poziomu oraz szczegółowa diagnostyka ultrasonograficzna. Ocena ultrasonograficzna określonych parametrów pozwala oszacować prawdopodobieństwo wystąpienia choroby hemolitycznej płodu i niedokrwistości będącej jej następstwem. Kolejnym krokiem diagnostycznym jest wykonanie badania grupy krwi oraz morfologii krwi płodu w celu ustalenia ewentualnych wskazań do wewnątrzmacicznego przetoczenia krwi. Odpowiednio prowadzona diagnostyka i leczenie dają duże szanse na urodzenie zdrowego dziecka.

Jeśli chodzi o konflikty matczyno- płodowe to perspektywy diagnostyki są obiecujące. Badania nad nieinwazyjną diagnostyką płodu w konfliktach serologicznych rozpoczęto na świecie pod koniec lat 90. XX wieku , a od 2000 roku są prowadzone w Instytucie Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie (IHiT), gdzie wdrożono protokoły dla konfliktu w antygenach RhD, Rhc, RhE i RhC z układu Rh i w antygenie K z układu Kell . Metody te są wykorzystywane przez ginekologów w przypadkach, gdy istnieje podejrzenie, że występujące u kobiety ciężarnej przeciwciała mogą spowodować chorobę hemolityczną płodów/noworodków. Wiadomo, że przeciwciała obecne u matki mogą być groźne, jeśli płód nosi antygen, do którego są skierowane. Wykrycie genu lub allelu płodu, kodującego antygen niezgodny z matką zawęża grupę kobiet wymagających ścisłego monitorowania HDFN i ewentualnego leczenia. Jeśli dziecko jest antygenowo ujemne, co może mieć miejsce, gdy ojciec dziecka ma heterozygotyczny genotyp, to przeciwciała mu nie zagrażają, gdyż są wynikiem poprzedniej ciąży lub immunizacji przez przetoczenie krwi. Wykazanie braku szukanego genu/allelu płodu w osoczu matki, przy potwierdzeniu obecności cff-DNA wykryciem markera dziedziczonego po ojcu, stanowi argument do zaniechania inwazyjnych zabiegów pobierania materiału od płodu (amniopunkcja, kordocenteza), które zawsze wiążą się z około 1-procentowym ryzykiem utraty ciąży i dodatkową immunizacją matki. W latach 2007–2008 w IHiT we współpracy z Regionalnymi Centrami Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa przeprowadzono analizę wykrywania przeciwciał do antygenów krwinek czerwonych u kobiet ciężarnych w Polsce. Zebrano dane od grupy stanowiącej około 48% wszystkich ciężarnych. Analizy te pozwoliły ocenić skalę immunizacji antygenem RhD i antygenami „nie-RhD” w Polsce i tym samym przewidzieć skalę ewentualnych badań nieinwazyjnych w ciążach zagrożonych HDFN. Szacuje się, że kobiet ciężarnych z przeciwciałami anty-D jest około 1000 rocznie. W około 400 przypadkach (40% kobiet teoretycznie powinno mieć RhD-ujemne płody) nieinwazyjne badanie RHD płodu pomogłoby wykluczyć konflikt matczyno-płodowy, a tylko pozostałe musiałyby być monitorowane pod kątem objawów HDFN. U kobiet RhD-ujemnych z rzadkimi przeciwciałami anty-G — obok nieinwazyjnego oznaczenia genu RHD istotne jest też oznaczenie statusu RhC płodu, ponieważ obecność RHD i/lub allelu RHCE*C potwierdza ryzyko wystąpienia HDFN z powodu przeciwciał anty-G. Z przeprowadzonych badań wynika też, że kobiet ciężarnych z przeciwciałami do innych antygenów niż antygen RhD, tak zwany „nie-RhD”, jest szacunkowo 2000 rocznie. Wśród nich największy odsetek stanowią kobiety z przeciwciałami anty-K lub anty-c (25%, czyli ~500). Przeciwciała anty-K mogą wywołać ciężkie objawy HDFN, podczas gdy HDFN z powodu przeciwciał anty-c ma zazwyczaj łagodną postać, ale u 20% przypadków wymaga wymiennego przetoczenia krwi — stąd duże znaczenie diagnostyczne opracowanych nieinwazyjnych badań prenatalnych. Przeciwciała anty-E też są stosunkowo często wykrywane. Rzadko wywołują ciężką postać HDFN, ale notowano pojedyncze przypadki o takim przebiegu. Wprowadzenie do praktyki klinicznej metody nieinwazyjnego genotypowania płodu jest więc zasadne. Dla diagnostyki pozostałych konfliktów matczyno-płodowych, między innymi w antygenie K, Fya/b, Jka/b, Coa , Dib , wciąż brakuje metod nieinwazyjnych, choć warto podkreślić, że stosunkowo rzadko wywołują one HDFN. Znajomość statusu RhD płodu jest także ważna dla profilaktyki konfliktu RhD, prowadzonej u kobiet bez przeciwciał. W Polsce jak dotąd immunoglobulinę anty-D podaje się dopiero po porodzie, kiedy można oznaczyć antygen RhD z krwi dziecka. Taki schemat obniżył odsetek przypadków immunizacji anty-D w drugiej ciąży po urodzeniu pierwszego RhD-dodatniego dziecka z 13–20% do poziomu 1,6% . Skuteczność obecnie stosowanego systemu profilaktyki szacuje się na około 90%. Przyczyny niepowodzenia wynikają głównie z zaniedbań w podawaniu immunoglobuliny anty-D, podania zbyt małych dawek w stosunku do liczby krwinek płodu przeciekających do krwioobiegu matki, z błędów w oznaczaniu antygenu RhD u noworodków, ale także z faktu, że u 1% kobiet Rh-ujemnych dochodzi do immunizacji już w trakcie pierwszej ciąży. Z tej przyczyny w wielu krajach wysoko rozwiniętych wprowadzono rekomendacje, by podawać immunoglobulinę anty-D 2-krotnie w 28 i 34 tygodniu ciąży albo jednorazowo w większej dawce w 34 tygodniu. Procedura taka zmiejsza częstość alloimmunizacji antygenem RhD do poziomu 0,3% . Ponadto chroni aktualną ciążę, a nie dopiero następną, która może nie mieć miejsca wobec tendencji zmiejszającej się dzietności społeczeństw. W krajach stosujących ten schemat immunoprofilaktyki rozważa się możliwości i zasadność oznaczania genu RHD płodu w osoczu matki w celu wykluczania z immunoprofilaktyki kobiet z RhD-ujemnym płodem. W dyskusjach nad takim projektem podkreśla się, że ograniczenie liczby kobiet poddanych immunoprofilaktyce jest ważne z punktu widzenia ekonomii (oszczędzanie drogiego, deficytowego preparatu anty-D), aspektów etycznych (ograniczenie liczby dawców krwi szczepionych krwinkami RhD-dodatnimi do jego produkcji) oraz zdrowotnych (eliminacja ryzyka przeniesienia nieznanych czynników zakaźnych w produkcie krwiopochodnym). Van der Schoot i wsp. przeanalizowała koszt wykonania takich badań u Rh-ujemnych ciężarnych i oszacowała, jak ich wprowadzenie wpłynie na koszty immunoprofilaktyki . Według obecnie obowiązującego schematu w Holandii immunoglobulinę anty-D w ciąży otrzymują tylko kobiety nieposiadające dzieci. Ograniczenie to wynika ze względów ekonomicznych oraz ze względu na ograniczoną dostępność preparatu anty-D (w Holandii wytwarza się preparat anty-D tylko z osocza dawców holenderskich). W tym schemacie immunoprofilaktyki wprowadzenie nieinwazyjnego badania genu RHD płodu kosztowałoby tyle, ile immunoglobulina anty-D niepotrzebnie podana kobietom noszącym RhD-ujemne płody (3,1 mln v. 3 mln euro). Gdyby immunoprofilaktyką objęto wszystkie RhD- -ujemne ciężarne, to nieinwazyjne badania przyczyniłyby się do 40% oszczędności (6,6 mln v. 3,9 mln euro). Wykonywanie badań genów/alleli płodu w osoczu antygenowo ujemnej kobiety ciężarnej podejrzewanej o konflikt serologiczny jest wysoko specjalistycznym badaniem. Trudności w wykonaniu takich badań wynikają z kilku przyczyn, które szczegółowo omówiono poniżej. Dla wykrycia genów płodu konieczne jest wyizolowanie odpowiedniej ilości płodowego DNA. W osoczu, jak powiedziano we wstępie, występuje tylko nieznaczna ilość cff-DNA; przeważającą część stanowi pozakomórkowe DNA matczyne. Konieczne jest więc izolowanie DNA z dużej objętości osocza, a tym samym pobranie przynajmniej 15–20 ml krwi. Dodatkowo ważne jest, by ograniczać proces rozpadu komórek matki, ponieważ z nich jest uwalniane dodatkowe matczyne DNA. Przeciwdziała temu pobieranie krwi do probówek z barierą żelową i napylonym EDTA (ethylene-diamine-tetra-acetic acid), które trzeba odwirować w ciągu 5 h, ściśle według zaleceń producenta, by nie spowodować zubożenia frakcji cffDNA. W tak odseparowanym osoczu cff-DNA jest stabilne w temperaturze pokojowej do 48 h od pobrania i w takich warunkach może być transportowane do laboratorium diagnostycznego . Probówkę zawierającą osocze, oddzielone od elementów morfotycznych barierą żelową, można też dostarczyć w stanie zamrożonym. Niedopuszczalne jest natomiast zamrażanie rozmrożonego osocza, ponieważ prowadzi to do degradacji cff-DNA. Ostatnio Fernando i wsp. z firmy Streck opisali nowy typ probówek przeznaczonych do badań prenatalnych, które nie mają bariery żelowej i nie wymagą odwirowania osocza, a cff-DNA jest w nich stabilne do 14 dni od pobrania. Metoda izolowania DNA musi być efektywna, przeznaczona dla pozyskiwania drobnocząsteczkowego DNA. Poleca się zestawy do izolowania kwasów nukleinowych wirusów, najlepiej z dużych objętości osocza (≥ 1 ml). Z uwagi na przewidywaną skalę badań i mniejsze ryzyko zanieczyszczenia „obcym” DNA (procedury dekontaminacyjne, bardziej zamknięty układ izolowania) duże oczekiwania wiąże się z wydajnymi metodami automatycznymi. Szczególnie przydatne wydają się metody z wykorzystaniem kuleczek magnetycznych opłaszczonych krzemionką, które lepiej wychwytują drobnocząsteczkowe DNA niż metody ze złożem ubitym w kolumnie. Metoda detekcji cff-DNA musi wykrywać pojedyncze kopie genów. Rutynowo używana obecnie metodologia RQ-PCR daje takie możliwości. Ważnym elementem jej standaryzacji jest wykazanie czułości wykrywania jednej kopii genu, poprzez sporządzenie krzywych wzorcowych z serii rozcieńczeń DNA pozyskanego od dawcy pozytywnego pod względem badanej cechy w DNA pozyskanym od osoby o przeciwstawnym genotypie. Wszystkie 3 wymienione elementy analizy cff-DNA są bardzo ważne z uwagi na konieczność ograniczania ryzyka wydania fałszywie ujemnego wyniku badania prenatalnego (brak lub niska koncentracja cff-DNA w pobranym osoczu z powodu nieprawidłowego odwirowania lub przechowywania osocza; niska wydajność izolowania cff-DNA; mała czułość metody RQ-PCR). W przypadkach z klinicznym podejrzeniem HDFN (obecne alloprzeciwciała u matki) wyniki fałszywie ujemne wiążą się z szczególnie dużym niebezpieczeństwem. Opierając się na nich, lekarz może podjąć niewłaściwą decyzję o zaniechaniu leczenia płodu, które może się okazać konieczne dla ratowania zdrowia i życia dziecka. W badaniach profilaktycznych kobiet RhD-ujemnych bez przeciwciał uzyskanie wyniku fałszywie ujemnego wiąże się z mniejszym zagrożeniem — kobieta nie dostanie immunoglobuliny anty-D w ciąży, ale dostanie ją po porodzie, po określeniu fenotypu D dodatniego krwinek dziecka. W każdym przypadku, w którym uzyska się wynik ujemny na poszukiwanie celowanego genu płodu, istnieje konieczność udowodnienia, że w próbce obecne było DNA płodu i że jego jakość i ilość były odpowiednie. Taki dowód uzyskuje się poprzez wykrycie genu/ów płodu, dziedziczonych po ojcu, a nie obecnych u matki. Dla płodów płci męskiej poszukuje się genu SRY z chromosomu Y, zawsze analizowanego w podstawowym protokole. Dla płodów płci żeńskiej jedyną możliwością jest, nie zawsze skuteczne, poszukiwanie ojcowskiego markera typu insercja/delecja (ins/del) . Pewne nadzieje wiązano z analizą epigenetyczną promotora genu RASSF1A, ponieważ płodowe sekwencje zawierają dużą ilość reszt metylowych (hipermetylacja), w odróżnieniu od sekwencji matczynych, z niewielkim odsetkiem reszt metylowych (hypometylacja). Enzymatyczne wytrawianie hypometylowanego DNA matki, a potem detekcja techniką RQ-PCR tylko metylowanych sekwencji promotora RASSF1A mają dowodzić obecności DNA płodowego w badanej próbce. Ta metodologia cechuje się niską specyficznością z powodu niecałkowitego dotrawienia matczynego DNA, co stwarza niebezpieczeństwo fałszywego potwierdzenia obecności materiału płodowego. Pojedyncze kopie drobnocząsteczkowego DNA z powszechnie występującymi genami, a do takich zalicza się gen RHD czy kontrolny gen SRY, mogą się przedostać do badanej próbki osocza zarówno w fazie przedanalitycznej (pobieranie krwi, separacja osocza), jak i analitycznej (izolowanie DNA, nastawianie reakcji RQ-PCR). „Obce DNA” może pochodzić z innej badanej próbki (kropelki krwi, osocza), z zanieczyszczonego sprzętu laboratoryjnego (wirówki, bloki grzejne, automatyczne ekstraktory DNA) lub stanowiska pracy, albo dostaje się do próbki z ciała operatora wykonującego badanie (złuszczony naskórek, wydychane powietrze z mikrokropelkami śliny). Dlatego dla nieinwazyjnych badań prenatalnych poleca się odpowiedni sposób pobierania materiału (separacja osocza bez otwierania probówek) oraz wykonywania izolowania DNA i detekcji RQ-PCR (odpowiedni strój laboranta, osobne pomieszczenia do izolacji i nastawiania RQ- -PCR, w miarę możliwości praca w komorze laminarnej; regularne procedury czyszczenia sprzętu laboratoryjnego i stanowisk pracy). Sprawą bezdyskusyjną jest restrykcyjne przestrzeganie zasad zapobiegania kontaminacjom produktami PCR w laboratorium (odpowiednia organizacja pomieszczeń części „czystej” i „brudnej”). Konsekwencje wydania wyniku fałszywie dodatniego z powodu powyższych przyczyn nie są wprawdzie tak duże jak w przypadku wyniku fałszywie ujemnego, ale mogą być fałszywym tropem, skłaniającym lekarza do wykonania zabiegu inwazyjnego (kobiety zimmunizowane), a w przypadku profilaktyki konfliktu RhD — do niepotrzebnego podania immunoglobuliny anty-D w ciąży. Rozdział cff-DNA od DNA matczynego staje się możliwy dzięki wykryciu fizykochemicznych właściwości różniących oba rodzaje DNA, obecne w osoczu kobiet ciężarnych. Analiza porównawcza liczby i wzajemnej proporcji różnej wielkości amplikonów, powielających gen specyficzny dla cff-DNA lub wspólny z DNA matczynym, wykazała, że > 99% cff-DNA zawiera fragmety mniejsze niż 300 pz, a większość DNA matczynego składa się z fragmentów większych niż 500 pz. Fragmenty DNA matczynego w osoczu kobiety ciężarnej są zdecydowanie dłuższe niż u mężczyzn i kobiet niebędących w ciąży . Wyniki badań techniką mikroskopii elektronowej struktur apoptycznych (tzw. APO-bodies [apoptotic-bodies]) obecnych w osoczu kobiet ciężarnych udowodniły, że cff-DNA jest uwięzione w małych strukturach odpowiadających pojedynczym nukleosomom (uwolnione mono-nukleosomy), zaś DNA matki jest zawarte w większych, niejednorodnych co do wielkości strukturach bogatych w chromatynę . Trop różnicowania nukleosomów z cff-DNA i chromatyny z DNA matczynym zaowocował wykryciem różnic w budowie histonu H3: większość cff-DNA jest opleciona wokół histonu H3.1, charakterystycznego dla tkanek płodu, zaś DNA matki oplata histon H3.3, typowy dla komórek osób dorosłych. Na poziomie sekwencji białkowej oba podtypy histonów H3 różnią się kilkoma aminokwasami, co pozwala na ich separację przy użyciu przeciwciał monoklonalnych. Odkrycie to zostało opatentowane, a metoda separacji z wykorzystaniem przeciwciał anty-H3.1 jest własnością firmy BIOCEPT, INC. San Diego, US. Separacja cff-DNA od DNA matki była przeprowadzana w żelach agarozowych, ale nie znalazła powszechnego zastosowania z uwagi na duże ryzyko kontaminacji i żmudność pracy przy tego typu manipulacjach. Nowe perspektywy wiążą się z elektroforezą kapilarną, szczególnie przeprowadzaną z wykorzystaniem technologii mikroukładów, tak zwanych lab-on-chip . Opracowanie metody wzbogacenia frakcji cff-DNA być może będzie perspektywą poprawy nieinwazyjnej diagnostyki klasyczną metodą RQ-PCR różnych chorób, determinowanych przez SNP (nie tylko konflikty serologiczne), czy chromosomalnymi aneploidiami. Rynek nowych technologii badania kwasów nukleinowych bardzo prężnie się rozwija. W ciągu ostatnich 4 lat pojawiły się publikacje o jego wykorzystaniu do analizy cff-DNA z osocza kobiet ciężarnych. Opisane metody pokonują trudności związane z niekorzystną proporcją cff-DNA względem DNA matczynego. Jedną z propozycji jest technika spektrometrii masowej MALDI-TOF, opierająca się na ilościowej analizie masy cząsteczkowej powielonych w PCR fragmentów genów, które dają różne wzory widm, nawet jeśli różnią się pojedynczym nukleotydem czy metylacją/demetylacją DNA. Opublikowano pracę o badaniu allelu KEL*1 płodu i genu kontrolnego RASSF1. W materiałach na stronie internetowej producenta systemu — firmy Sequenom — można znaleźć informacje o wynikach adaptacji techniki do konfliktu RhD. Drugą aplikacją jest digital PCR, w którym wykorzystuje się możliwość badania pojedynczych kopii genów, dzięki prowadzeniu reakcji PCR w setkach kanalików, które są obecne w specjalnie konstruowanych mikrofluidowych płytkach. Ze względu na mniejszą wielkość — cząsteczki cff-DNA efektywniej wnikają do tych kanalików i podnosi się odsetek wykrywanych genów płodu (w 3. trymestrze z 6% na 20% względem DNA matki) . Trzecią techniką jest sekwencjonowanie nowej generacji, pozwalające na analizę ogromnej liczby genów jednocześnie. Propozycji metodologii i sprzętu jest kilka . Na razie prace na temat analizy cff-DNA ograniczają się do dwóch producentów i dotyczą anaploidii, a autorzy podkreślają możliwość wieloczynnikowego (w tysiącach sekwencji) potwierdzenia nieprawidłowej liczby chromosomów — na przykład trisomii chromosomu 13, 18, 21. Być może jest to pomysł na wieloaspektową analizę przyczyn konfliktu serologicznego — identyfikację różnych polimorfizmów grup krwi. Wszystkie te technologie są jednak na razie w fazie opracowań i zmierzają do wytworzenia gotowych testów dla nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej, która będzie tania w przeliczeniu na jednostkowe badania, ale droga w aspekcie wyposażenia aparaturowego i wyszkolenia personelu. Zmierzają też do komercjalizacji badań. Powszechne ich stosowanie to kierunek rozwoju diagnostyki w przyszłości, ale na obecnym etapie najbardziej przystępną techniką genotypowania cff-DNA wciąż pozostaje RQ-PCR. Opracowanie metodyki nieinwazyjnych badań prenatalnych w konfliktach serologicznych było możliwe dzięki grantom KBN i MNiSW, których inicjatorem i kierownikiem była prof. dr hab. n. med. Barbara Żupańska. Dziękujemy pracownikom laboratoriów i lekarzom, którzy zajmują się kobietami w ciąży, a także im samym za zainteresowanie naszymi badaniami — bez próbek osocza, badań serologicznych oraz obserwacji klinicznych nie byłyby możliwe. (autorzy: ViaMedica - Katarzyna Guz, Agnieszka Orzińska, Izabella Kopeć, Magdalena Krzemienowska, Justyna Smolarczyk-Wodzyńska, Ewa Brojer ).