Takie osiągnięcia pozwalają na wprowadzenie diagnostyki powikłań cukrzycy na nowe poziomy. Mimo, że dużo już wiemy na ten temat to nadal jest jeszcze wiele do odkrycia poza tym gdy już naukowcom uda się w miarę dobrze poznać różne opcje diagnostyczne łatwiej będzie również rozwijać dalej terapie lub zastosować leczenie nowego typu mające na celu zapobieganie patologicznym zmianom w nerkach.
Dodano5 lat temu
Diagnoza uszkodzenia nerek łatwiejsza dzięki nowemu biomarkerowi
6
odpowiedzi
412
wejść
0
ocena
Cukrzyca to bardzo podstępna choroba, która bardzo często nie daje żadnych objawów. Bardzo ważne jest to aby regularnie badać poziom glukozy we krwi. Wiele osób nie robiąc tego, a dodatkowo prowadząc niezdrowy tryb życia naraża się na rozwój cukrzycy. W takich przypadkach istnieje właśnie duże ryzyko rozwoju chociażby neuropatii, retinopatii czy tak jak wspomniano w artykule nefropatii. Według mnie to bardzo dobrze, że udało się opracować taki biomarker. Jestem bardzo zadowolona z tego, że do takiego odkrycia doszło właśnie w naszym kraju. Być może dzięki temu takie rozwiązanie będzie mogło być dużo wcześniej wprowadzone. Im wcześniej jakaś choroba zostanie wykryta tym większe są szanse na jej wyleczenie lub zmniejszenie ilości powikłań, które mogą stanowić zagrożenie dla zdrowia, a nawet życia.
Każde informacje o nowych odkryciach, które pomogą w diagnostyce jakichkolwiek chorób niezwykle mnie cieszy. Według szacunkowych danych przewlekła choroba nerek może dotyczyć 4,5 miliona Polaków, z czego aż 90 proc. nie zdaje sobie z tego sprawy – choroba rozwija się podstępnie i latami. Większość zgonów z powodu PChN to zgony przedwczesne. Przewlekła choroba nerek (PChN) to drugie pod względem częstości zapadnia przewlekłe schorzenie w Polsce. PChN to wieloobjawowy zespół chorobowy, którego objawy utrzymują się przynajmniej ponad 3 miesiące. Do rozwoju choroby dochodzi w wyniku trwałego uszkodzenia lub zmniejszenia liczby czynnych nefronów niszczonych przez różnorodne procesy chorobowe toczące się w miąższu nerek. Poza przewlekłą postacią niewydolności nerek spotyka się również jej odmianę o ostrym przebiegu, do której dochodzi w wyniku urazu, niedokrwienia czy działania substancji toksycznych – w przeciwieństwie do PChN w jej przypadku możliwe jest przywrócenie właściwego funkcjonowania nerek. W początkowych stadiach PChN może przebiegać bezobjawowo, wręcz skrycie, a pacjent przez długi czas nie będzie odczuwał żadnych niepokojących symptomów. Niestety, im później wykryta, tym rokowania mogą być gorsze. Do najczęstszych przyczyn PChN zaliczamy: cukrzycową chorobę nerek, nefropatię nadciśnieniową, kłębuszkowe zapalenie nerek, cewkowo-śródmiąższowe choroby nerek, wielotorbielowate zwyrodnienie nerek, ostrą niewydolność nerek i nefropatię niedokrwienną. Czynnikami wpływającymi na podniesienie ryzyka zachorowania są m.in.: cukrzyca, otyłość, obciążenia rodzinne, palenie papierosów oraz częste zażywanie leków przeciwzapalnych i przeciwbólowych. Eksperci podkreślają, że niezwykle ważne jest wykonywanie badań przynajmniej raz w roku. Jeśli potencjalny chory jest w grupie ryzyka – dwukrotnie. Przewlekła choroba nerek to schorzenie właściwie nieuleczalne. W terapii stosuje się leczenie nefroprotekcyjne (farmakologiczne i żywieniowe) oraz nerkozastępcze (hemodializa, dializa otrzewnowa i ostatecznie przeszczep nerki). Kluczowe we właściwej diecie u pacjenta z PChN jest takie ukształtowanie sposobu odżywania się, by ograniczyć przyjmowanie białek – jest to jednak wyniszczające i obciążające dla organizmu. Taki chory wymaga nie tylko opieki dietetyka, ale również właściwej suplementacji. Specjaliści wskazują, że dobrym preparatem wzbogacającym dietę niskobiałkową mogą być ketoanalogi aminokwasów. Zapobiegają one zubożeniu diety, a w konsekwencji niedożywieniu i osłabieniu organizmu. Zadaniem dietetyka jest nie tylko zaplanowanie optymalnej dla pacjenta ilości energii, białka, pozostałych makro- i mikroskładników, ale także ocena realizacji zaleceń dietetycznych. Niestety, w Polsce dostęp do dietetyka w poradniach nefrologicznych jest bardzo ograniczony. NFZ nie refunduje porad dietetycznych, mimo że korzyści wynikające z dietoterapii (nie tylko dla pacjenta) są powszechnie znane i poparte wynikami wielu badań. Warto zatem zadać pytanie: dlaczego w Polsce poradnictwo dietetyczne dla pacjentów nefrologicznych nie istnieje jako świadczenie gwarantowane ani w podstawowej opiece zdrowotnej, ani też w ambulatoryjnej opiece specjalistycznej? Nie wynika to z pewnością z braku wykształconych dietetyków. Zastosowanie leczenia żywieniowego na większą skalę pozwoliłoby nie tylko na późniejsze włączaniu u chorych bardziej obciążających form terapii, ale również na ograniczenie kosztów leczenia przewlekłej choroby nerek - oraz jej powikłań, np. chorób układu sercowo-naczyniowych - dla całego systemu. Już sama dializoterapia stanowi bardzo duże obciążenie finansowe, nie mówiąc o pogorszeniu jakości życia chorego. Koszty niezbędnej terapii 31 000 pacjentów, leczonych nerkozastępczo dializami lub przeszczepami nerki, wyniosły w roku 2018 prawie 2 mld złotych.
W życiu, jak w pokerze – czasami trzeba powiedzieć: sprawdzam! Ta zasada bezpieczeństwa obowiązuje w wielu sferach życia, dotyczy też zdrowia. Zdrowie od czasu do czasu warto po prostu skontrolować. Nawet wówczas, gdy nic nam nie dolega. Na tym polega nowoczesna medycyna – badamy, czy organizm działa prawidłowo, gdy jesteśmy zdrowi, bo stawiamy na to, żeby ubiec ewentualną chorobę. A już koniecznie powinniśmy skontrolować zdrowie, gdy pojawiają się dolegliwości. O obu regułach pamiętajmy zwłaszcza wówczas, gdy zaczynamy drugie pięćdziesiąt lat życia lub mamy tych lat jeszcze trochę więcej. Badania mogą nieść ze sobą bardzo wiele informacji – podkreślają specjaliści: interniści, nefrolodzy, diabetolodzy, kardiolodzy. Osłabienie z niedokrwistości, znużenie. Sucha skóra, siniaki i obrzęki. Zaburzenia akcji serca. Ból kości oraz złamania. Zaburzenia pamięci i kłopoty ze snem. Nocne oddawanie moczu. Co mają ze sobą wspólnego składniki tej wyliczanki? Takie objawy mogą sygnalizować nieprawidłowe działanie nerek. Recz jest ważna. Coraz więcej osób dotyka przewlekła niewydolność nerek, co roku przybywa kilka tysięcy pacjentów. Jak szacują epidemiolodzy, z tym problemem może zmagać się nawet co 10. Polak. Najczęściej chorują ludzie pomiędzy 45. a 75. rokiem życia. Ciekawe, ilu z nas wie, czy ich nerki pracują prawidłowo? Choroby nerek często rozwijają się długo, nie dając żadnych objawów, choćby bólu. Dopiero analiza krwi i moczu może pomóc wychwycić zmiany wskazujące, że w organizmie dzieje się coś niedobrego. Jeśli zauważamy któreś z wcześniej wymienionych symptomów, to już może być znak, że praca nerek zaczyna szwankować. Co ważne, niewydolności nerek sprzyjają: cukrzyca, nadciśnienie, miażdżyca, palenie papierosów i wiek, z czasem bowiem nasze ciało zaczyna gorzej funkcjonować. Dlatego przynajmniej raz do roku róbmy badanie krwi oraz badanie moczu. W ten sposób możemy zapobiec skutkom choroby. W każdej minucie przez nerki przepływa około litra krwi. Działają równocześnie jak filtr i oczyszczalnia, pozwalając organizmowi na wchłonięcie wody i substancji, których potrzebuje: białek, aminokwasów, sodu, potasu, wapnia, fosforu, a usuwają szkodliwe produkty przemiany materii. Ale to nie wszystko. Zapewniają równowagę zasadowo-kwasową organizmu, regulują ciśnienie krwi, wytwarzają erytropoetynę – hormon niezbędny do tego, by szpik kostny produkował czerwone krwinki oraz witaminę D, odpowiedzialną za stan kości. Od nich zależy działanie praktycznie wszystkich narządów.
Chore nerki długo nie powodują żadnych dolegliwości, a gdy już dadzą o sobie znać, np. w sytuacji stresowej, wtedy zaczyna chorować cały organizm. Chorują na nerki, ale nie mają tej świadomości. I to jest dla nas potężny problem, ponieważ na choroby nerek cierpi co najmniej 14-15 proc. dorosłych. To więcej niż w innych krajach, gdzie choruje 11-12 proc. Wynika to przede wszystkim ze stylu życia. Jemy niezdrowo, jemy dużo soli – więcej niż w innych krajach. Nie leczymy nadciśnienia tętniczego albo leczymy je źle. Co drugi pacjent, który trafia do leczenia nerkozastępczego (czyli taki, który już stracił czynność swoich nerek), nigdy nie miał rozpoznanej niewydolności nerek. Choroby nerek są po prostu nierozpoznawane. Można by pomyśleć, że żaden pacjent w Polsce nie umarł na nerki. Wszyscy umierają na serce, na udar, na raka. A podstawą zwiększającą częstość tych schorzeń jest właśnie choroba nerek. Ale nikt sobie z tego nie zdaje sprawy. Choroba nerek kilkakrotnie zwiększa ryzyko powikłań każdej innej choroby. Ktoś, kto ma chore nerki, ma ogromny problem z całym organizmem. Przykład: kobieta w ciąży z chorymi nerkami ma siedmiokrotnie większe ryzyko powikłań. Co gorsza, ona teoretycznie może mieć te nerki w pełni wydolne, z dobrymi parametrami; może trochę białka jest w moczu, trochę krwinek czerwonych, niby nic wielkiego. Ale faktycznie nerki mogą być już chore, co uwidoczni się w chwili stresu. Nerki są nieprawdopodobnie niedocenianym narządem, o czym się nie rozmawia. Choroba nerek często pozostaje niewykryta, gdyż nikt nie zadbał o to, żeby zrobić badania. Nie bada się w tym kierunku i stąd jest problem. A nie bada się, bo nie ma świadomości ani wśród lekarzy podstawowej opieki zdrowotnej, ani wśród społeczeństwa. Sama nerka nie daje żadnych objawów, powiedzmy sobie to jasno. Nawet jeżeli tworzą się kamienie nerkowe, to dają dolegliwości ze strony dróg moczowych, ze strony miedniczek, moczowodu – tam jest ból. Natomiast same nerki nie bolą, chyba że toczy się proces ropny, tak jak w odmiedniczkowym zapaleniu nerek lub przy ropniu nerki. Nawet rak nerki nie daje żadnych objawów, stwierdza się go najczęściej przypadkiem. Nie mamy wciąż, niestety, programu prewencji. Badanie moczu i kreatyniny to standardowe badanie przesiewowe wykonywane dla sprawdzenia, czy wszystko jest w porządku. Ludzie dbający o siebie powinni to robić – tak jak się bada piersi, robi cytologię czy kolonoskopię. Na te choroby są programy profilaktyczne, a na ten niezwykle ważny problem, jakim są chore nerki, nie ma. I to nie są wielkie pieniądze – badanie ogólne moczu i oznaczenie stężenia kreatyniny kosztuje mniej niż 10 zł. Rocznie wydalibyśmy na ten program może kilkanaście milionów. Natomiast oszczędności z tego tytułu byłyby ogromne. W tej chwili na leczenie chorób nerek, którym nie zapobiegliśmy, wydajemy 2 mld zł rocznie. Takie są koszty braku profilaktyki.
Troszkę może długie ale fajnie rozszerzony poruszony temat !
Najnowocześniejsze technologie wykorzystywane przez
współczesną naukę pozwalają na poszukiwanie nowych,
wczesnych, a przede wszystkim czułych markerów uszkodzenia
nerek w moczu. Jest to materiał łatwy do uzyskania
i niewymagający stosowania metod inwazyjnych. Ideałem
byłoby zidentyfikowanie jednego czułego markera, którego
oznaczenie dałoby wyniki łatwe do interpretacji i pozwoliłoby
nie tylko na potwierdzenie uszkodzenia nerek, ale także na
precyzyjne wskazanie miejsca uszkodzenia narządu w przypadku,
kiedy w materiale biopsyjnym nie są jeszcze widoczne
zmiany morfologiczne lub są one minimalne. Idealny marker
powinien również umożliwić różnicowanie typów chorób
nerek, ze wskazaniem na konkretny typ uszkodzenia, biorąc
po uwagę dostępne dane kliniczne i ocenę stanu nerek po
zastosowaniu konwencjonalnych parametrów klinicznych,
z możliwością zastosowania w różnych populacjach, biorąc
pod uwagę rasę, wiek i płeć.
Prowadzone badania, związane z poszukiwaniem nowych
markerów diagnostycznych, ukierunkowane są zarówno na
poszukiwanie zmian w ekspresji genów (transkryptomika,
genomika funkcjonalna), jak i na poszukiwanie nowych białek
lub innych związków organicznych o niewielkiej masie
cząsteczkowej (proteomika, metabolomika, metabonomika),
pojawiających się w moczu w procesie chorobowym, bądź
też w zaprojektowanym laboratoryjnie modelu danej choroby
nerek.
Problem braku odpowiednio czułego i wczesnego markera
uszkodzenia nerek widoczny jest szczególnie w badaniach
klinicznych, gdzie konieczna jest ocena efektu nefrotoksycznego
badanych preparatów. Nowoczesne technologie, takie
jak mikromacierze, pozwalają na analizę zmian w ekspresji
wielu genów jednocześnie, co jest pomocne w wyłonieniu
potencjalnych biomarkerów. Tym sposobem wytypowano
kilka genów, których ekspresja zmienia się w przypadku
ostrego uszkodzenia nerek Są to m.in. geny kodujące takie
białka jak klusteryna, osteopontyna, S-transferaza glutationu
α, lipokalina związana z żelatynazą neutrofilów (NGAL-
1 – neutrophil gelatinase-associated lipocalin), inhibitor
metaloproteinaz typu 1 (TIMP-1), cząsteczka uszkodzenia
nerek typu 1 (KIM-1 - kidney injury molecule), interleukina
18 (Il-18) oraz cystatyna C. Amerykańska Agencja ds. leków
i Żywności (FDA) oraz Europejska Agencja ds. Leków (EMA)
do oceny wczesnego uszkodzenia nerek przez preparaty testowane
w badaniach klinicznych rekomendują stosowanie:
KIM-1, klusteryny, cystatyny C, albumin i β2-mikroglobuliny
oraz białka TFF3 (trefoil factor 3), a także stężenia białka
w moczu.
Badania ostatnich lat skupiają się na poszukiwaniu markerów
wczesnej diagnostyki chorób nerek związanych z uszkodzeniem
kłębuszków nerkowych. Wcześnie pojawiające się
zmiany mogą być związane z uszkodzeniem podocytów lub
zmianami w błonie podstawnej. Mogą być one wykrywalne
jedynie przy zastosowaniu zaawansowanych technik laboratoryjnych,
takich jak mikroskopia fluorescencyjna czy elektronowa,
pozwalające na ocenę zmian w tkance na poziomie
niedostępnym dla klasycznie stosowanej w ocenie bioptatów
nerki mikroskopii świetlnej.
Mianem podocyturii określa się obecność podocytów w moczu.
Wskaźnik ten może być markerem uszkodzenia nerek.
Wykazano, że podocyty są wydalane z moczem i można
je hodować w warunkach in vitro. Badania związane
z oceną liczby podocytów w moczu wskazują, że ocena
podocyturii może być znacznie czulszym wskaźnikiem, aniżeli
powszechnie stosowane oznaczenia stężenia białka
w moczu. Co więcej, wykazano, że podocyturia występuje
na długo przed pojawieniem się białkomoczu i wzrostem poziomu
kreatyniny we krwi oraz innych objawów klinicznych,
związanych z uszkodzeniem nerek. Określenie liczby
podocytów wydalanych z moczem może być wskaźnikiem
aktywności choroby nerek.
Do identyfikacji podocytów w moczu stosuje się najczęściej
metody mikroskopii fluorescencyjnej wykorzystujące znakowane
fluorochromami przeciwciała skierowane przeciwko
białkom powierzchniowym charakterystycznym dla tych
komórek. Najczęściej znakowane są: podokaliksyna (PDX),
która jest zlokalizowana w części apikalnej komórki, nefryna
i podocyna - białka błony szczelinowej oraz synaptopodyna,
a także białko guza Willmsa 1 (WT1), pełniące funkcje
czynnika transkrypcyjnego i ulegające ekspresji w jądrze komórkowym.
Podejmuje się również próby analizy fenotypowej
i ilościowej komórek kłębuszka nerkowego izolowanych
z osadu moczu za pomocą cytometrii przepływowej.
Do chwili obecnej nie zidentyfikowano jednak jednego markera
charakterystycznego dla tych komórek, pozwalającego
w łatwy sposób określić ich liczbę w próbce moczu. Co
więcej, w moczu mogą znajdować się również komórki nabłonka
ściennego torebki Bowmana (PEC - parietal epithelial
cells), które również mogą wykazywać ekspresję białek charakterystycznych
dla podocytów, np. podokaliksyny, dlatego też właściwa ocena uzyskanych preparatów komórkowych
wymaga zastosowania określonego panelu przeciwciał,
z jednej strony, oraz współpracy doświadczonego cytologa,
z drugiej. Ponadto, metody oceny komórek w osadzie moczu
są czasochłonne i niosą ze sobą ryzyko przeszacowania,
ze względu na to, że poza podocytami, w osadzie moczu
mogą znajdować się również fragmenty komórek, które
uległy zniszczeniu w procesie patologicznego odklejania
się od błony podstawnej, bądź też w trakcie przechodzenia
przez drogi moczowe. Z tego też powodu należałoby udoskonalić
metodykę pozyskiwania komórek z osadu moczu
tak, aby była to metoda łatwa w wykonaniu oraz opracować
metodykę identyfikacji izolowanych podocytów, charakteryzującą
się dużą czułością i swoistością oraz wystandaryzować
opracowane techniki tak, aby wyniki uzyskiwane przez
poszczególne jednostki mogły być ze sobą porównywalne.
Dotychczas brak jest również norm dotyczących liczby
podocytów w moczu, zarówno wśród osób zdrowych, jak
i w poszczególnych jednostkach chorobowych, do których
można byłoby odnieść wyniki własnych oznaczeń.
Wykazano, że podczas uszkodzenia nerek podocyty uwalniają
do przestrzeni moczowej białka powierzchniowe.
Za pomocą metod immunoenzymatycznych oraz techniką
Western blot w moczu wykrywane są białka charakterystyczne
dla podocytów, np. podokaliksyna, nefryna i podocyna
(supernatant i osad moczu). Na podstawie tych obserwacji
powstał termin nefrynurii, na określenie dużej zawartości nefryny
w próbkach moczu. Nefrynurię opisano w wielu modelach
eksperymentalnych oraz w chorobach przebiegających
z białkomoczem. Co ciekawe, badania osób z cukrzycą typu
1 wskazują na znaczny poziom nefrynurii, nie związanej
z mikroalbuminurią, który może sugerować wartość diagnostyczną
tego wskaźnika w ocenie wczesnego uszkodzenia
podocytów kłębuszka nerkowego, jeszcze przed wystąpieniem
mikroalbuminurii .
Podobnie, jak w przypadku nefryny, wykazano związek
pomiędzy poziomem podokaliksyny w moczu (wyrażonym
w stosunku do poziomu kreatyniny) a stopniem uszkodzenia
nerek i nasileniem choroby w przypadku nefropatii IgA, toczniowego
zapalenia nerek oraz popaciorkowcowego kłębuszkowego
zapalenia nerek.
Alternatywą dla wykrywania komórek nabłonka trzewnego
kanalików nerkowych, czy też ich białek w osadzie moczu,
jest ocena poziomu mRNA dla tych białek, z wykorzystaniem
ilościowej metody łańcuchowej reakcji polimerazy z odwrotną
transkryptazą (qRT-PCR – quantitative reverse transcriptase
polymerase chain reaction). Wykazano, że poziom
mRNA dla nefryny i podocyny, w osadzie moczu, koreluje
ze stopniem uszkodzenia nerek. Wielkość współczynnika
opisującego stosunek ilości mRNA podocyny do mRNA
nefryny (PNR) może stanowić użyteczny wskaźnik progresji
choroby nerek. Co więcej, jak pokazały badania, poziom
mRNA dla tych białek lepiej odzwierciedla stopień aktywności
glomerulopatii aniżeli białkomocz. Ponadto, na podstawie
tych parametrów można wykazać różnicę pomiędzy świeżo
zaistniałym uszkodzeniem nerek a zmianami już istniejącymi
. Podwyższony wskaźnik, opisujący stosunek pomiędzy
ilością mRNA glikoproteiny B7.1 a mRNA nefryny w osadzie
moczu, może być z kolei markerem różnicującym nefropatię
zmian minimalnych (MCD - minimal-change disease) od
ogniskowego segmentalnego stwardnienia kłębuszków nerkowych
(FSGS, - focal segmental glomerulosclerosis) [20].
Użyteczność oznaczania profilu mRNA w moczu w różnicowaniu
stopnia uszkodzenia nerek w nefropatii cukrzycowej
wykazał zespół Zhenga. Na podstawie reakcji q-RTPCR
wykazali oni związek pomiędzy poziomem mRNA dla
białek podocytów tj. synaptopodyna, podocyna, podokaliksyna,
białko CD2-AP i α-aktynina 4, a stężeniem kreatyniny
w surowicy krwi, stężeniem białka w moczu oraz wielkością
eGFR. Cytowani badacze wykazali również użyteczność
metody wykorzystującej całe panele genów (mikromacierze
mRNA) jako narzędzia charakteryzującego się wysoką
wydajnością i czułością do oceny zmian w poziomie ekspresji
mRNA w osadzie moczu, ze wskazaniem przyszłych
kierunków poszukiwania nowych biomarkerów uszkodzenia
nerek.
Egzosomy to cząsteczki o średnicy 30 – 100nm, zbudowane
z podwójnej błony białkowo–lipidowej, białek przezbłonowych
oraz rdzenia hydrofilowego zawierającego białka,
mRNA i microRNA. Różnią się one od innych tego typu cząstek
wielkością oraz tym, że powstają w obrębie endosomów
i uwalniane są na zewnątrz drogą egzocytozy. Egzosomy
uważane są za nośniki horyzontalnego transferu informacji
pomiędzy różnymi komórkami. W ten sposób mogą
uczestniczyć w indukcji zmian epigenetycznych. Uwolnione
z danego typu komórki, za pośrednictwem specyficznych ligandów,
mogą wchodzić w interakcje z innymi komórkami,
z biologicznie aktywnymi lipidami oraz specyficznymi białkami
receptorowymi. Egzosomy obecne są we wszystkich płynach
ustrojowych, w tym również w moczu. Jak wykazano,
uwalniają je niemal wszystkie komórki nabłonkowe pozostające
w kontakcie z przestrzenią moczową. Co więcej, wskazuje
się na nie, jako na potencjalne markery diagnostyczne
we wczesnym uszkodzeniu nerek.
Egzosomy można w prosty sposób wyizolować z osadu
moczu. W tym celu wykorzystuje się metody separacji z zastosowaniem
kulek magnetycznych, sprzężonych ze specyficznymi
przeciwciałami. Szeroko stosowane są również metody
tj. ultrafiltracja moczu z zastosowaniem nanomembran,
ultrawirowanie oraz ultrawirowanie w gradiencie gęstości,
często połączone z chromatografią wykluczenia (SEC – size
– exclusion chromatography), rozdzielającą cząsteczki w zależności
od wielkości, a w niektórych przypadkach również
masy. W dalszym etapie prowadzi się identyfikację wyizolowanych mikrocząstek za pomocą specyficznych przeciwciał
znakujących białka powierzchniowe z zastosowaniem cytometrii
przepływowej. W analizie morfologicznej i biochemicznej
tych struktur wykorzystuje się mikroskopię elektronową
i mikroskopie sił atomowych, immunoblotting, spektrometrię
mas lub immunofluorescencję.
Badania z zastosowaniem immunoblottingu mogą dostarczyć
informacji na temat zawartości egzosomów i zmian
tej zawartości, jakie zachodzą w różnych procesach patologicznych.
Wykazano, że egzosomy mogą koncentrować
czynniki transkrypcyjne. Z wykorzystaniem modelu ostrego
uszkodzenia nerek (AKI) oraz modelu uszkodzenia podocytów
kłębuszka nerkowego, wykazano podwyższony poziom
aktywowanego czynnika transkrypcyjnego typu 3 (ATF3)
w AKI oraz czynnika transkrypcyjnego guza Wilms`a (WT1)
we wczesnym uszkodzeniu podocytów. Markerem
wskazującym na wystąpienie AKI może być również obecność
fetuiny-A w egzosomach izolowanych z moczu.
Różnice w zawartości białek w egzosomach izolowanych
z moczu, wykazano również u pacjentów z nefropatią IgA
i nefropatią cienkich błon podstawnych. Wszystkie te
obserwacje wskazują na potencjalną możliwość wykorzystania
egzosomów w poszukiwaniu nowych biomarkerów. Ponadto
egzosomy, będące nośnikami mRNA i microRNA, stanowią
dodatkową pulę materiału genetycznego możliwego
do oznaczenia. Jak wykazano, przeprowadzenie wydajnej
izolacji egzosomów może w znacznym stopniu zwiększyć
czułość i swoistość analiz mRNA z moczu. Jakkolwiek
dotychczas brak jednoznacznych informacji na temat tego
czy i w jakim stopniu uszkodzenie nerek, białkomocz czy też
wystąpienie niedokrwienia wpływa na zmianę ilości egzosomów
uwalnianych do przestrzeni moczowej.
Mikrocząstki to struktury błonowe o średnicy 100 – 1000 nm,
uwalniane z powierzchni komórek, złożone z fragmentu błony
komórkowej zawierającej często białka powierzchniowe
charakterystyczne dla tych komórek. Podobnie jak egzosomy,
mikrocząstki stanowią integralny składnik mikrośrodowiska
międzykomórkowego i można je odnaleźć we wszystkich
płynach ustrojowych, w tym również w moczu. Ich
ilość oraz skład może być wskaźnikiem zmian zachodzących
w organizmie, dlatego też wiele badań koncentruje się
na poszukiwaniu wśród nich potencjalnych biomarkerów.
W badaniach podocytów i ich uszkodzenia w przebiegu kłębuszkowych
zapaleń nerek wykazano, że poza komórkami
nabłonkowymi i białkami powierzchniowymi, do przestrzeni
moczowej uwalniane są także fragmenty błon podocytów,
zawierające na swej powierzchni białka charakterystyczne
dla tych komórek. Obecność struktur błonowych wykazujących
ekspresje podokaliksyny wykazał zespół Hary.
Cytowani autorzy analizowali osady moczu, pochodzące
od dzieci z zespołem nerczycowym, metodą immunofluorescencji
pośredniej. Wykazali oni obecność struktur niekomórkowych,
wykazujących reakcję pozytywną z podokaliksyną.
Szczegółowa analiza z zastosowaniem mikroskopii
elektronowej pozwoliła na zidentyfikowanie tych struktur,
nazwanych PPGS (podocyte positive granular structures),
jako ziarnistości zbudowanych z błony komórkowej, niezawierających
białek cytoszkieletu. Obecność na powierzchni
podokaliksyny, może sugerować pochodzenie tych cząsteczek
z części apikalnej komórki podocytów i odzwierciedlać
dynamikę zmian w błonie komórkowej komórek kłębuszka
nerkowego w odpowiedzi na uszkodzenie. Dalsza analiza
wykazała brak markerów egzosomalnych na powierzchni
tych struktur (CD24 i CD63), co sugeruje, że nie pochodzą
one z egzosomów podocytów, a raczej z pęcherzyków mikrokosmków
zlokalizowanych w części szczytowej podocytów
kłębuszka nerkowego. Zmiany w ilości mikrocząstek
wykazujących ekspresję podokaliksyny mogą świadczyć
o zaistniałym uszkodzeniu w obrębie kłębuszka nerkowego.
Jednakże, podobnie jak w przypadku oceny całkowitej liczby
podocytów w osadzie moczu, brakuje jednego markera charakteryzującego
mikrocząstki pochodzenia podocytarnego.
MicroRNA (miRNA) to krótkie, niekodujące cząsteczki kwasu
rybonukleotydowego, długości 20 – 22 nukleotydów, które
uczestniczą w regulacji wielu procesów fizjologicznych.
Te endogennie produkowane transkrypty stanowią element
horyzontalnego transferu informacji. Wpływają na procesy
ekspresji genów, poprzez blokowanie procesu translacji
białek lub przez indukowanie degradacji powstałego RNA.
Odkrycie tych cząsteczek na początku lat dziewięćdziesiątych
ubiegłego stulecia, zrewolucjonizowało dotychczasową
wiedzę na temat mechanizmów regulacji ekspresji genów,
mających wpływ na przebieg wielu procesów biologicznych,
tj. proliferacja i różnicowanie komórek, apoptoza czy metabolizm,
a także powstawania i rozwoju procesów patologicznych
w komórkach i tkankach organizmu.
Dzięki porównaniu profilu ekspresji miRNA w różnych narządach,
wykazano istnienie grupy miRNA specyficznych
dla nerki, składającej się z miR-192, miR-194, miR-204,
miR-215 i miR-216. Dalsze badania wykazały zróżnicowanie
ekspresji miRNA w obrębie kory i rdzenia nerki,
co może wskazywać na istnienie różnic funkcjonalnych
w obrębie tych cząstek. Specyficzność narządowa czyni
miRNA doskonałymi kandydatami na nowe biomarkery powstawania
i rozwoju zmian patologicznych w nerce.
Dotychczas do oznaczania miRNA w materiale biologicznym
wykorzystywano metody sekwencjonowania z puli całkowitego
RNA. Dostępne dziś techniki typu blot RNA, pozwalają
na jakościową i ilościową analizę wielu cząsteczek miRNA
w próbkach całkowitego RNA. Rozwój technik z zastosowaniem
mikromacierzy umożliwił oznaczenie jednorazowo
do kilku tysięcy cząsteczek miRNA w jednej próbce. Do
oznaczeń ilościowych i jakościowych miRNA w próbkach
biologicznych zaadaptowano również technikę PCR w czasie
rzeczywistym z zastosowaniem odwrotnej transkryptazy
(real time reverse-transcription PCR).
Związek pomiędzy regulacyjną funkcją miRNA a rozwojem
zmian patologicznych w obrębie kłębuszków i kanalików nerkowych, wykazano po raz pierwszy u myszy z delecją
genu kodującego Dicer w komórkach podocytów. Jest to
enzym niezbędny do produkcji funkcjonalnych cząsteczek
microRNA. U zmutowanych myszy zaobserwowano
białkomocz, zmiany w błonie filtracyjnej kłębuszka, zmiany
w morfologii podocytów (wakuolizacja i przerost komórek,
odróżnicowanie, związane z zaburzoną strukturą białek cytoszkieletu
oraz utratę ekspresji synaptopodyny), odklejanie
się wyrostków stopowatych podocytów od błony podstawnej,
zaburzenia w procesach apoptozy i proliferacji oraz wypadanie
podocytów do przestrzeni moczowej i rozrost komórek
mezangium. Obserwowano szybki postęp zmian prowadzących
do albuminurii, szkliwienia kłębuszków oraz włóknienia
cewkowo – śródmiąższowego, co prowadziło do schyłkowej
niewydolności nerek i śmierci. Dzięki badaniom z zastosowaniem
mutantów Dicer zidentyfikowano trio miRNA,
charakterystyczne dla danego typu komórek w prawidłowym
kłębuszku nerkowym: komórek endotelialnych (miR-126),
komórek mezangialnych (miR-145) oraz podocytów (miR-
30a). Okazało się, że delecja Dicer wiązała się z całkowitą
utratą zdolności do syntezy cząsteczek miRNA przez podocyty,
co potwierdzał całkowity brak miR-30a, bez zmian
w ekspresji miR-126 i miR-145. Badania wykazały istotną
rolę miRNA w fizjologii i patologii nerki, w tym kłębuszków
nerkowych i podocytów (szczególnie miR-30) i zapoczątkowały
serię prac związanych z poszukiwaniem potencjalnych
markerów uszkodzenia nerek.
Zmiany w profilu miRNA wykazano m.in. w biopsjach nerki
pacjentów z nefropatią cukrzycową, wielotorbielowatością
nerek, nefropatią toczniową, nefropatią IgA, w guzach nerek,
w procesie włóknienia oraz w odrzucaniu nerki przeszczepionej.
Duże nadzieje na opisanie potencjalnych biomarkerów
wczesnego uszkodzenia nerek, wiąże się z wykryciem miRNA
we wszystkich płynach ustrojowych. Dotychczas opisano
22 różnych cząsteczek miRNA w moczu. Mimo że żadna
z tych cząsteczek nie jest specyficzna dla nerki, badania
wskazują na zmiany w profilu tych cząsteczek w moczu
w różnych stanach chorobowych. Hanke i wsp. wykazali
zmiany w ekspresji miRNA izolowanych z osadu moczu
w raku pęcherza moczowego oraz w toczniu układowym.
Na podstawie różnic w ekspresji miR-27b i miR-192,
pochodzących z egzosomów izolowanych z moczu, dokonano
różnicowania pacjentów z toczniem, któremu towarzyszy
zapalenie nerek od tych, którzy takich komplikacji nie
wykazują, oraz pomiędzy nefropatią kłębuszkową a cewkową,
jak wykazano w modelu uszkodzenia nerek u szczura
. Wśród pacjentów z nefropatią IgA wykazano obniżoną
ekspresję miR-200a, miR-200b i miR-429, która korelowała
z nasileniem choroby, ocenianym na podstawie standardowo
oznaczanych parametrów funkcji nerek, w tym wielkości
białkomoczu. Z kolei analiza poziomu miRNA, należących
do grupy regulatorów odpowiedzi immunologicznej,
w tej grupie pacjentów wskazała znacząco wyższy poziom
ekspresji miR-146a i miR-155 zarówno w moczu, jak
i w tkance, związany istotnie ze stopniem zaawansowania
zarówno klinicznego, jak i histopatologicznego choroby.
W badaniach miRNA izolowanych z moczu u dzieci z idiopatycznym
zespołem nerczycowym wykazano znacząco wyższy
poziom ekspresji miR-30a-5p, którego spadek korelował
z poprawą kliniczną pacjentów uzyskiwaną w trakcie leczenia
. Ponadto Wang i wsp. wykazali znacząco wyższy
poziom miR-10a i miR-30d w moczu pacjentów z FSGS,
w porównaniu z osobami zdrowymi, wskazując jednocześnie
na potencjalną możliwość wykorzystania tych cząsteczek
we wczesnej diagnostyce uszkodzenia nerek. Według autorów,
ocena poziomu miR-10a i miR-30d charakteryzuje się
wyższą czułością w porównaniu z klasycznie oznaczanym
poziomem mocznika we krwi, w korelacji uzyskanych wyników
z obrazem histopatologicznym. Za pomocą metody profilowania
cząsteczek miRNA wykazano również 1,2-krotnie
wyższy poziom miR-21 oraz 1,5-krotnie niższy poziom miR-
155 w moczu pacjentów z ostrą niewydolnością nerek, w porównaniu
z grupą kontrolną. Badania z wykorzystaniem
mRNA wykazały, że badane miRNA uczestniczą w regulacji
ekspresji genów zaangażowanych w procesy apoptozy
i proliferacji komórek. Autorzy wskazują na znaczenie tych
dwóch typów miRNA w patogenezie ostrego uszkodzenia
nerek oraz na możliwości diagnostyczne zarówno miR-21,
jak i miR-155 we wczesnej diagnostyce tego typu uszkodzenia.
Z kolei, Neil i wsp. porównywali poziom wybranych
miRNA (miR-16, miR21, miR-155, miR-210 i miR-638)
w moczu pacjentów w różnych stadiach przewlekłej choroby
nerek (CKD – chronic kidney disease) oraz u pacjentów
leczonych nerkozastępczo. Cytowani badacze nie wykazali
istotnych różnic w poziomie ekspresji tych miRNA w różnych
stadiach zaawansowania choroby nerek oraz w porównaniu
z grupą osób zdrowych, za wyjątkiem miR-638, który wykazywał
znaczący wzrost w moczu pacjentów znajdujących się
w stadium 4 CKD, w porównaniu z grupą kontrolną i grupą
w stadium 3 CKD. Uzyskane wyniki mogą sugerować,
niewielki udział nerek w fizjologicznym usuwaniu krążących
miRNA, a także na inny profil zmian w ekspresji
tych cząsteczek w zależności od stopnia zaawansowania
uszkodzenia nerek. Istnieje również możliwość, że miRNA
w moczu ulegają degradacji w stopniu większym, aniżeli
w osoczu krwi, ze względu na zwiększoną akumulację białek
niskocząsteczkowych w moczu, tj. RNazy, które mogą
mieć wpływ na poziom miRNA. Badania miRNA we krwi
wskazują, że tylko niewielka część tych cząsteczek krąży
swobodnie. Znaczna większość jest związana z nośnikiem,
chroniącym je przed degradacja, którym mogą być mikrocząstki,
kompleksy białkowe zawierające białka Argo-1 lub
2 lub też lipidy o wysokiej gęstości. Mimo wielu
niewiadomych, badania nad miRNA trwają nadal, a wyniki
wydają się być obiecujące zarówno w obszarze wczesnej
diagnostyki chorób nerek, badań nad patogenezą, jak
i w kontekście poszukiwania potencjalnych celów terapeutycznych.
Dotychczas nie istnieje jeden czuły i swoisty marker diagnostyczny
chorób nerek. Nadal istnieje konieczność wykonywania
oznaczeń kilku parametrów oceniających funkcje nerek,
zarówno w moczu, jaki i we krwi obwodowej. Ideałem byłoby
skonstruowanie jednego konkretnego panelu markerów, którego
oznaczenie w jednoznaczny sposób wskazałoby, nie
tylko na zaistnienie uszkodzenia, ale również pozwoliłoby na
sprecyzowanie miejsca w nefronie, gdzie takie uszkodzenie
nastąpiło. Póki co, wykorzystując zdobycze współczesnej
nauki w diagnostyce medycznej, poszukiwania takich markerów
wciąż trwają. Biorąc pod uwagę coraz więcej doniesień
na temat zaburzeń w ekspresji miRNA w chorobach nerek,
jest nadzieja na zastosowanie tych cząsteczek nie tylko
w badaniach nad patogenezą chorób nerek, w przewidywaniu
wczesnych zmian i w diagnostyce klinicznej, a także jako
cel terapeutyczny w przewlekłych chorobach nerek, osiągnięty
dzięki możliwości takiego manipulowania poziomem
miRNA, aby doprowadzić do przywrócenia właściwej ekspresji
genów i usprawnienia funkcji nerek. ( autorzy publikacji: Agnieszka Czyżewska-Buczyńska, Andrzej Konieczny i wsp. )
Dodaj odpowiedź
Aby dodać odpowiedź musisz się
zalogować